采樣、包裝和運輸
采樣
ASF 的任何實驗室檢測都始于樣品采集。樣品采集過程中重要的考慮因素是調查的目的，例如診斷、監測或無疫認證。對哪些動物采樣將取決于抽樣的目的。例如，當調查疫情爆發( 被動監測) 時，應對針對患病和死亡動物，而在檢查動物是否暴露于病原( 主動監測) 時，應對年齡最大的動物進行抽樣。
負責抽樣( 并進行臨床檢查) 的人員在開展相關操作前應該接受過保定豬的技術培訓( 包括臨床檢查和取樣)。
采樣小組應根據采樣動物的數量準備充足的采樣設備( 見插文4)，并包含可能由于其他原因( 例如，失效的真空采血管) 而丟失或不可用的材料數量。另外，數據收集、個人防護/ 生物安全和樣品運輸的物品必須包裝( 參見插文4 中的“樣品運輸材料”)。
建議準備一份現場采樣表格，以便將現場收集所有樣品和相關信息統計到一起。如果預期將樣品提交給區域/ 國際參考實驗室，建議一式兩份取樣，以便對提交的樣品進行留樣，避免在反復凍融/ 分割樣品。
取樣應小心謹慎，并按照適當的方法避免對動物造成過度的應激或傷害，或對采樣人員造成傷害。應無菌收集并注意避免交叉污染，并始終使用新的針頭以避免疫病傳播。所有等待檢測的樣品都應該被認為有感染性并應進行相應處理。養殖場使用的所有采樣材料應按照當地法規進行安全處理，例如，裝袋并運送回實驗室進行高壓滅菌/ 適當處置。
提交到診斷實驗室的相關樣品應有清晰且保存持久的標簽，樣品質量良好。
樣品類型
a) 全血
使用含有抗凝血劑(EDTA - 紫色蓋) 的無菌管( 真空采血管) 從頸靜脈、下腔靜脈或耳靜脈抽取全血。如果動物已經死亡，可以從心臟中采血，但必須立即進行。
避免使用肝素( 綠色蓋子)，因為其可以抑制PCR 反應(造成假陰性)，和/ 或由于紅細胞吸附試驗(HAD) 造成假陽性的產生。血液是PCR 檢測和病毒分離的目標樣品。通過離心分離出的血漿可以用間接免疫過氧化物酶試驗(IPT) 或間接熒光抗體(IFA) 試驗進行抗體的檢測。
通過干血斑(DBS) 進行微量體積血液樣品的采集和儲存，以便進一步進行DNA和/ 或抗體檢測。這些卡片在偏遠地區或者在無法冷鏈運輸的時候很有幫助，比如在熱帶地區的狩獵環境和農村地區。然而，使用干血斑(DBS) 進行非洲豬瘟檢測時，基因組和/ 或抗體檢測測試的靈敏度低于全血或血清樣品。通過將幾滴由刺血針或無菌注射器針頭從動物的靜脈或皮膚滴加到特制的吸水濾紙中完成干血斑(DBS) 樣品的收集。血液樣品應該完全浸透在濾紙，并風干數小時。將樣品儲存在低透氣性的塑料袋中，加入干燥劑以減少濕度，即使在熱帶氣候下也可以保持在環境溫度中。
b) 血清
使用未加抗凝劑( 紅色蓋子) 的真空采血管從頸靜脈、下腔靜脈、耳緣靜脈，或剖檢過程收集血液樣品。返回實驗室后，血液樣品應在4±3℃下放置14-18 小時以分離血凝塊(譯者：此處與我國實際操作不同，僅供參考)。棄去凝固物，并離心10-15 分鐘后，回收澄清的上清液( 血清)。如果血清是紅色，這表明樣品發生了溶血，可以在酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 中產生假陽性反應。通常已經死亡動物的血液樣品易發生溶血( 例如野豬)。血清樣品在分離后可以立即開展抗體和病毒檢測，或者在<-70ºC 下儲存備用。對于抗體檢測，儲存在-20℃已足夠，但是對于病毒檢測，最好存于更低溫度。
c) 器官和組織樣品
雖然所有的豬器官和組織都可以用來檢查ASFV 的存在( 主要是該病的急性和亞急性的形式)，但目標器官是脾臟、淋巴結、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟。
其中，脾臟和淋巴結是最重要的，因為通常它們的病毒含量是最高的。骨髓也可用于死亡野生動物病例，因為如果動物已經死了一段時間，則骨髓可能是唯一相對保存完好的組織?？梢酝ㄟ^關節內組織液以檢查低毒力毒株的存在。建議將樣品保持在4℃，盡快(48 小時內) 提交給實驗室。如果由于物流原因無法保障的，樣品可以儲存在冷庫或液氮中。對于組織病理學研究，也可以同時提交用10% 緩沖福爾馬林浸泡的樣品。雖然這些樣品不能用于進一步的病毒分離研究，但可用于PCR 反應和免疫組織化學試驗。
通過PCR 反應、病毒分離和/ 或抗原檢測ELISA 的方法進行病毒檢測時，需要將樣品用磷酸鹽緩沖液制備成10%(w / v) 的均質組織懸液。在離心后，建議對上層清液進行過濾，并用0.1% 的抗生素在4±3 ºC 處理1 小時。經過勻漿處理組織可以立即用于ASFV 病毒和/ 或核酸的檢測，或存儲在< -70ºC 備用。對于PCR 反應，建議對10 倍稀釋樣品或上清進行檢測的同時，對未稀釋樣品也進行檢測。從脾臟、肝臟和肺等臟器中提取的滲出物對于使用免疫過氧化物酶試驗(IPT) 和間接熒光抗體試驗(IFA) 方法檢測抗體非常有用(Gallardo，2015)。
d) 軟蜱樣品
鈍緣蜱屬軟蜱可以用于檢測ASFV 和病毒基因組?？蓮酿嘭i的洞穴、裂縫/ 洞穴中收集蜱蟲，有時也可以從豬圈內的嚙齒類動物的洞穴中收集。不同種類的蜱會有不同偏好的場所和棲息地。有三種收集技術：手動收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應讓蜱保持存活或直接儲存在液氮中，以確保蜱內病毒的保存完好，并避免DNA 降解。
包裝和運輸樣品
為了獲得正確的診斷，必須在適當的溫度下、以最快的速度正確采集樣品。仔細進行包裝、做好標記并送到實驗室。ASF 的診斷緊急，樣品必須通過最直接的路線送到最近的有資質的實驗室。樣品必須附有一份提交表格，具體說明樣品的數量和類型、種類、采樣地點( 根據具體情況填寫地址、縣、區、省、來源國家等信息)。此外，還列出了所需要的檢測項目、提交樣品人的姓名，以及觀察到的臨床癥狀、病變、發病率、死亡率、受影響動物的數量、歷史和動物種類。如果是家畜，應該標注養殖場的所有者、養殖場的名稱和飼養模式，再加上需進行的鑒別診斷項目列表。每個樣品應能對應到來源動物。填寫信息最低要求可能因實驗室而異。采樣之前打電話給實驗室，有助于確保遵循正確的提交程序，以保證所送樣品的數量能在一定時間內能夠完成分析及儲存。
樣品應盡快到達檢測實驗室，以避免變質并確保最佳效果。應該保障運輸過程中的安全，以免在運輸途中感染其他動物或人，并避免污染樣品本身。運送的樣品必須有足夠數量的冷卻材料，例如冰袋，以防止變質。如果樣品狀況不佳，則無法做出準確的診斷。
陸地運輸
將樣品運送到最近的實驗室時，即使樣品由獸醫服務人員攜帶，也必須遵守國家規定。如果沒有可用的規定，應遵循《OIE陸生動物診斷和疫苗手冊》中所述的聯合國示范條例2 (2016 年;第1.1.2 和1.1.3節)。即使在公路運輸的情況下也應使用三重包裝。圖27 列出了三重封裝特性的詳細例子。
航空運輸
這些樣品應該按照規定3 運輸，并使用“三重包裝系統”。特別是如果樣品通過空運運輸，發貨人必須遵守國際航空運輸協會(IATA) 的《危險品條例(DGR)》，包裝應符合《危險品條例(DGR)》中的第6504 條包裝說明。
非洲豬瘟的診斷樣品被認為是危險的 — 必須被包裝，并正確標記，以防止病毒的泄漏。因此，應使用滿足規格的產品( 即符合國際航空運輸協會(IATA) 運輸診斷樣品的要求，如95KPa 壓力測試，跌落試驗)。要尋找該類型容器和包裝的供應商，請在互聯網搜索關鍵字，如“95 KPa”和“UN3373”、“瓶”、“管”、“袋子”，則通常會找到適當的信息。
• 主要的容器. 樣品應該儲存在防漏、防水、無菌的容器中( 這些應該是主要的容器)，如圖27 所示。每個主要容器不得超過1 升。每個容器的蓋子應用膠帶或石蠟膜密封。這些密封的主要容器應該是用減震/ 吸收材料單獨包裝，以吸收容器或管子任何可能的泄漏，并防止沖擊。必須用防水墨水標記每個容器，以明確識別來自于哪只動物。
• 二次包裝.所有這些主容器應放置在二次防漏、密封、防水的容器中，材質可以為塑料或金屬。二次包裝必須能夠承受-40℃至55℃的溫度范圍，耐受95 KPa(0.95 bar)的內部壓力，且無泄漏。吸收材料也應放置在二次容器內。如果將多個易碎的主容器放置在單個二次容器中，則必須單獨包裝或分離，以防止相互接觸。
注意1)由于存在發生爆炸的危險，請勿將干冰放入主容器或二次容器內。2)主要容器必須能夠承受-40℃至55℃的溫度范圍5，耐受95 KPa(0.95 bar)的內部壓力，且無泄漏。
• 堅硬的外部包裝. 二次容器必須確保用合適的緩沖材料外包裝。應該已經成功地通過了在1.2 米的高度的跌落測試，并標有UN3373 標記。外包裝在盛裝液體的情況下不得超過4 升，在固體物質的情況下不得超過4 公斤。當冷藏樣品時，不包括冰、干冰或液氮的重量。
樣品必須在4℃溫度運送，通常為短期運輸（1-2 天）
如上所述進行包裝，如果空運，應根據國際原子能機構(IAEA)包裝規范650，將樣品與制冷劑(足夠的數量以保持所需的溫度)放置在隔熱、堅固的箱子進行運輸。
必須冷凍運輸的樣品（-20℃或-70℃）
對于超過三天以上的運輸：這些材料也應按指定的方式包裝，并在隔熱箱中添加足夠的干冰以保持溫度。確保二次包裝在箱子的中心是固定的，這一點很重要，因為當干冰分解的時候，二次容器會松動。由干冰分解產生的二氧化碳氣體(CO2)降低PH 值并使病毒滅活;因此，所有主要和二次容器必須密封。當干冰被用來在運輸過程中冷藏樣品時，外部包裝必須允許釋放氣體(即不能密封)以防止壓力的積聚，從而破壞包裝。切勿凍結全血或含凝血劑的血清。
1. 標簽和標記
箱體外部(剛性外包裝)應標有以下標識 ：
1.“B 類生物物質”標簽(圖28)，其正確的運輸名稱旁邊標注“B 類生物物質”;
2. 發件人的全名、地址和電話號碼;
3. 收件人的全名、地址和電話號碼;
4. 了解運輸情況的負責人員的全名和電話號碼，如，負責人：姓名、+電話號碼;
5. 標簽上標明“在4 攝氏度”或“在零下70 攝氏度”保存。如果使用了干冰;
6. 貼有“干冰”標簽(圖29);
7. 聯合國(UN) 編號和帶有干冰的正確運輸名稱，后附有“作為冷卻劑”。干冰的凈數量(千克)必須清楚地寫在圖29 周圍，例如，UN1845、干冰、作為冷卻劑、凈重，## 千克。
2. 文件
運往實驗室的樣品必須附有該實驗室提供的申請表格，或者，如果不能提供，則提供附信。該信件應包括有關動物所有人、養殖場名稱、養殖場的所在地、飼養模式、涉及動物、病史、臨床體征和死后病變的相關信息。必須注明所需的檢測項目。
運輸單據：如果跨國境運輸，需要進口或出口許可證，以及實驗室接受傳染性物質診斷許可證的副本等(有時需要)。這些要求因國家而異。詢問接收方實驗室進口診斷樣品是否需要上述相關文件。
3. 運輸
在運輸樣品前，請盡早與接收實驗室聯系并通知其有關預期的裝運，包括詳細信息和大致的到達日期和時間。最好是安排送貨上門服務，直接送到實驗室。一旦派送樣品，快遞員應向目的地實驗室提供其公司名稱，如果有的話，應提供貨物的跟蹤號碼和/ 或空運單號。如果使用空運，有必要與接收實驗室事先安排，在抵達機場時接收貨物(一些國際實驗室有該系統，但也不是全部都有)。必須告知接收實驗室航空公司的名稱、航班號和航空運單號。嚴禁人員將傳染性物質放入托運或手提行李中，嚴禁隨身攜帶傳染性物質。
運輸分離/ 培養的非洲豬瘟病毒
分離/ 培養的ASF 病毒必須按照A 類感染性物質運輸。聯合國的編號是UN2900，正確的運輸名稱是“感染動物的傳染性物質(非洲豬瘟病毒)”，并符合第620 號包裝要求。箱子外面的標簽和標記也是不同的。
《危險品條例》要求所有參與運輸的人員進行適當的培訓，特別是對A 類具有傳染性的物質的運輸，人員必須按照相應的要求進行培訓，包括參加批準的課程、通過考核和獲得認證(有效期為兩年)。有關更多信息，請參閱《世衛組織傳染病運輸條例指南》。
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