非洲豬瘟的實驗室診斷
由于非洲豬瘟缺乏預防用疫苗，為防止疫病的傳播，就需要實施嚴格的衛(wèi)生和生物安全控制措施，而這就依賴于疫病的快速、可靠的早期診斷。ASF 的診斷是指確診動物正在感染，或者曾經(jīng)感染過ASFV。因此，適用的診斷技術(shù)包括檢測和識別ASFV 特異性抗原、DNA 或抗體的技術(shù)，所獲取的檢測信息也是控制和根除計劃的重要保障。在選擇診斷技術(shù)時，分析疫病感染期非常重要( 圖30)。由于感染動物所處的感染期不同，因此在疫情和控制/ 根除計劃中，需要同時檢測病毒和抗體以確保準確性。
根據(jù)報道，ASF 的自然感染潛伏期為4~19 天。在臨床癥狀出現(xiàn)的兩天前，ASF 感染動物開始散播大量病毒。病毒散播因所感染的ASFV 毒株毒力不同而異。感染后約7-9 天血清轉(zhuǎn)陽，抗體陽性可持續(xù)終生( 圖30)。
病原學檢測為陽性( 即抗原) 則表明，所檢測的動物在取樣時正在發(fā)生感染。而抗體檢測陽性則表明感染正在或者已經(jīng)發(fā)生，包括感染后已經(jīng)恢復的動物( 且
可能終身保持血清陽性)。
自2015 年底以來，東歐血清學流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示血清學陽性動物的檢出率顯著增加，特別是在發(fā)生疫情的歐盟國家的野豬群體中尤為明顯。這些結(jié)果表明，ASF 感染耐過動物可存活超過一個月并可能出現(xiàn)亞臨床感染的病例，就像在伊比利亞半島、美洲和非洲之前所描述的情況。因此，抗體檢測技術(shù)對于實施控制和根除計劃所需的完整信息而言是必要的。
非洲豬瘟病毒檢測
應用聚合酶鏈式反應(PCR) 檢測非洲豬瘟病毒基因組
PCR 已成功應用于豬樣品(血液、器官等)和蜱中ASFV 基因組的檢測。病毒DNA 片段通過PCR 擴增獲得足以檢測的量，從而實現(xiàn)檢測。所有經(jīng)過驗證的PCR 技術(shù)均可以在臨床癥狀出現(xiàn)前實現(xiàn)檢測。PCR 能在樣品到達實驗室數(shù)小時內(nèi)，完成ASF 的診斷。PCR 是可以代替病毒分離鑒定的一種靈敏、特異、快速的ASFV 檢測技術(shù)。同時，相比于抗原檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和直接熒光抗體測試(FAT)，具有更高的敏感性和特異性。需要注意的是，PCR 的高度敏感性使其容易發(fā)生交叉污染，應該采取適當?shù)念A防措施來減少和
控制污染風險的發(fā)生。
OIE 在《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》(2016 年)中推薦使用的常規(guī)和實時熒光PCR 得到了長期的充分驗證，是常規(guī)診斷的重要工具。此外，除了OIE 推薦的適用于康復動物ASF 基因組檢測的實時熒光PCR 技術(shù)外，其他研究者建立的實時熒光PCR 已經(jīng)證實更為敏感。在這些分子技術(shù)中使用的引物和探針多以VP72 編碼區(qū)域作為靶基因設計，該基因片段是ASFV 基因組中研究清楚，且高度保守的區(qū)域。應用這些PCR 技術(shù)，即使在滅活或降解的樣品中也可檢測到已知所有22 種p72 病毒基因型的多個毒株。
對于特急性、急性或亞急性ASF 感染病例， PCR 是首選的檢測技術(shù)。此外，由于PCR 檢測病毒基因組，即使病毒分離鑒定為陰性的、含有無感染性病毒粒子的樣品，也可完成檢測，這也使其成為用于檢測感染低或中等毒力毒株的重要工具。雖然聚合酶鏈式反應(PCR)不能提供病毒感染性的信息，但可以提供定量的信息。
非洲豬瘟病毒分離
病毒分離是將樣品接種易感的豬源原代細胞、單核細胞和巨噬細胞而進行的檢測。如果在樣品中存在ASFV，則會在易感細胞中復制，在感染細胞中產(chǎn)生細胞病變(CPE)。細胞裂解和細胞病變(CPE) 通常在出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象的48-72 小時后發(fā)生。ASFV 的紅細胞吸附試驗是該病毒特有的檢測技術(shù)，其他豬源病毒在白細胞培養(yǎng)物中不存在紅細胞吸附特性。當病毒在這些培養(yǎng)物中復制時，多數(shù)ASFV 毒株會產(chǎn)生紅細胞吸附反應(HAD)，在感染的白細胞周圍吸附豬紅細胞形成 “玫瑰花環(huán)”( 圖31)。
此外，需要說明的是，在沒有發(fā)生紅細胞吸附反應的時候出現(xiàn)CPE，可能是由于接種物的細胞毒性所致，或者由于其他病毒如偽狂犬病毒的感染，或者由于不產(chǎn)生紅細胞吸附反應的ASFV 毒株導致。一旦發(fā)生這類情況，必須采用其他的病毒學檢測技術(shù)如FAT 或PCR，檢測細胞沉淀物是否存在ASFV。而如果細胞分離沒有觀察到任何變化，或者FAT 和PCR 檢測為陰性，則需要將細胞培養(yǎng)上清– 再次接種新的培養(yǎng)物種，連續(xù)傳代3-5 代，之后方可確認為ASFV 陰性。
對于抗原檢測(ELISA、PCR 或FAT)為陽性的樣品，推薦HAD 為完成病毒分離和鑒定的參考試驗。而如果通過其他方法已經(jīng)證實ASF 感染，特別是在首次暴發(fā)ASF 的地區(qū)，也建議使用紅細胞吸附試驗鑒定病毒。此外，病毒分離對于進一步的分子生物學研究也是必要的基礎(chǔ)。
直接熒光抗體法對非洲豬瘟抗原的檢測
FAT 可用于檢測豬組織中的ASFV 抗原。檢測原理是通過顯微觀察感染臟器涂片或薄層冷凍切片上的病毒抗原實現(xiàn)的。使用異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的特異性抗體檢測細胞內(nèi)抗原。FAT 也可用于檢測未觀察到HAD 的白細胞培養(yǎng)物中的ASFV 抗原，因此可以鑒定不產(chǎn)生HAD 反應的ASFV 毒株。FAT 還可用于鑒別CPE 是由ASFV 感染導致的，還是由其他病毒感染或者導致的接種的細胞毒性導致的。
陰陽性對照是保證切片被正確判定的重要保障。該方法也是對特急性和急性ASF 病例的高度敏感的檢測技術(shù)，且可以非?？焖俚耐瓿蓹z測。雖然FAT 是高效的檢測技術(shù)，但目前已被PCR 逐步取代，所需試劑也不再廣泛使用。然而值得一提的是，在亞急性和慢性型感染中，F(xiàn)AT 的敏感性明顯降低(40%)。
ELISA 對非洲豬瘟抗原的檢測
也可以使用ELISA 檢測病毒抗原，其成本比PCR 更為低廉，并且可在沒有特殊的實驗室儀器設備的條件下，短時間內(nèi)對樣品的大規(guī)模篩查。然而，與FAT 相似，對于亞急性和慢性病例，抗原ELISA 的敏感性明顯較低。同時，現(xiàn)地樣品通常狀態(tài)不佳，因此也降低了檢測的敏感性。因此建議抗原ELISA(或其他ELISA)主要用于 “群體”檢測，并輔助以其他病毒學和血清學檢測。
非洲豬瘟抗體檢測
血清學檢測技術(shù)因其簡便、低成本和無需特殊的儀器設備，而成為最常用的檢測技術(shù)。由于ASF 尚沒有可用的疫苗， ASFV 抗體陽性即表明當前或者曾經(jīng)發(fā)生了感染。此外， ASFV 抗體在感染早期即可出現(xiàn)，并持續(xù)數(shù)年。然而，在特急性和急性感染中，豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽性前已死亡。因此，在疫病暴發(fā)的早期階段，建議采集樣品檢測病毒DNA。
對于檢測ASF 抗體，推薦使用ELISA 篩查抗體陽性樣品，并采取免疫印跡試驗(IB)或間接熒光抗體(IFA)試驗進行確認。此外，間接免疫過氧化物酶的抗體檢測技術(shù)也可用作豬血清和組織滲出物中ASF 抗體檢測的替代試驗。該技術(shù)也適用于大量樣品的檢測，而無需昂貴的熒光顯微鏡設備，且敏感性較高。
ELISA 對非洲豬瘟抗體的檢測
ELISA 是一種常用的檢測技術(shù)，廣泛用于多種動物疫病的大規(guī)模血清學調(diào)查。該方法的顯著特點是靈敏度高、特異性好、速度快、成本低，結(jié)果清晰。借助于自動化設備的使用，可以實現(xiàn)大量樣品的快速篩選。
ELISA 使用標記物檢測血清樣品中的ASF 抗體。ELISA 使用的標記通常是某種酶。當抗原和抗體彼此結(jié)合時，酶引起底物發(fā)生顏色變化，從而鑒定ASF 陽性樣品。目前，多種用于ASF 抗體檢測的間接或阻斷ELISA 已實現(xiàn)商品化供應，或者由實驗室“自主”建立。
血清處理或保存不當(儲存或運輸不當)，如溶血樣品可能會產(chǎn)生高達20%的假陽性結(jié)果。因此，通過ELISA 檢測的所有陽性和可疑樣品必須通過其他血清學替代試驗確認。
免疫印跡試驗(IB)技術(shù)是用于蛋白質(zhì)檢測和鑒定的快速、靈敏的檢測技術(shù)。IB 技術(shù)的原理是抗原抗體的特異性結(jié)合。IB 技術(shù)中使用了覆蓋有病毒抗原的紙條，首先是抗原溶解、電泳分離、以及轉(zhuǎn)移到薄膜上(通常是硝化纖維素膜)，之后與特異性一抗反應，再與標記二抗作用后，產(chǎn)生可直接觀察的陽性反應條帶。
ASFV 感染后首先刺激機體產(chǎn)生抗體的多種病毒蛋白，通過在IB 試驗，可在所有感染動物中標定地檢測到。動物感染后7-9 天血清轉(zhuǎn)陽，并可在康復動物體內(nèi)存在幾個月。接種其他病毒疫苗的動物血清，可能會產(chǎn)生非特異性反應，因此需要借助于如IPT 或者FAT 等技術(shù)進行確認。
間接熒光抗體試驗(IFA) 對非洲豬瘟抗體的檢測
該技術(shù)的原理是用具有細胞適應性的ASFV 毒株，感染單層綠猴腎細胞，再通過特異性抗原抗體反應實現(xiàn)對ASF 抗體的檢測?？乖贵w反應通過耦聯(lián)的熒光素進行檢測。陽性樣品在感染細胞的胞漿中出現(xiàn)特異性熒光。IFA 是一種快速、高度敏感和特異的ASF 抗體檢測技術(shù)，適用于血清、血漿或組織分泌物中抗體的檢測。
間接免疫過氧化物酶試驗(IPT) 對非洲豬瘟抗體的檢測
免疫過氧化物酶試驗(IPT) 是一種細胞免疫化學技術(shù)，細胞固定后通過耦聯(lián)的過氧化物酶實現(xiàn)抗原抗體復合物的檢測。在IPT 反應過程中，綠猴腎細胞感染了適應于這些細胞的ASFV 適應株。感染細胞首先被固定，之后用作抗原以確定樣品是否存在針對ASF 的特異性抗體。與FAT 檢測一樣，IPT 是具有高度的敏感性和特異性的快速檢測技術(shù)，適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測ASF 抗體。但因為采用了酶學顯色系統(tǒng)，其結(jié)果判定比FAT 更為簡單。
綜上所述，目前可用的診斷技術(shù)可通過綜合病毒和抗體檢測來確診ASF。實時熒光PCR 是最廣泛應用的病毒學診斷技術(shù)，可敏感、特異、快速的實現(xiàn)ASFV 核酸的檢測。
由于存在交叉污染的可能，來自無疫區(qū)的單個動物(例如野豬)的PCR 陽性，或在一群動物中出現(xiàn)的單個PCR 陽性樣品，應采取其他的病毒檢測方法，以及結(jié)合血清學、病理學和流行病學調(diào)查的結(jié)果綜合確診。由于PCR 所檢測到的陽性是病毒核酸陽性，而不是感染性病毒粒子，因此，在PCR 之外，強烈推薦新的意思感染地區(qū)。在報告發(fā)生疫情前，先從感染樣品中分離獲得病毒以確認。
雖然經(jīng)過驗證的ELISA 是檢測ASF 抗體的候選技術(shù)，特別是對血清樣品的初步篩查，但應時刻注意檢測的局限性。應使用其他的確證試驗，如IB、IFA 或IPT，以發(fā)現(xiàn)ELISA 檢測中的假陽性樣品。此外， IFA 和IPT 是組織滲出液和血漿樣品檢測的首選技術(shù)，因為他們能完整展示流行病學過程，并可確定感染的具體時間。
ASF 準確的診斷必須包括病毒學和血清學檢測結(jié)果，同時結(jié)合臨床、病理和流行病學的調(diào)查結(jié)果。表5 總結(jié)了ASF 的主要實驗室診斷技術(shù)及其特性。
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